小分子誘導的靶蛋白選擇性降解是目前最有前途的新一代藥物發現方法之一。以 PROTACs（PROteolysis-TArgeting Chimeras）為例，雙功能小分子可以誘導靶蛋白連接到E3連接酶上，隨后形成靶蛋白/PROTAC/連接酶三元復合物，促進細胞靶蛋白通過蛋白酶體降解（下圖）。

由于PROTAC的二價性質，三元復合物的形成從根本上說是一個多過程。PROTAC分子可以首先與目標蛋白質結合，如果與連接酶的親和力較高，則連接酶結合后很可能會啟動三元復合物的形成。如果PROTAC與一種蛋白質的結合因另一種蛋白質的存在而增強或減弱，要充分理解平衡，就必須將協同效應在內（下圖）。在存在協同效應的情況下，相互作用不再是獨立的--正協同是由于與中心分子結合的其中一種成分促進了三元復合物的形成，而負協同則意味著這種結合抑制了進一步的相互作用。

而下圖中所呈現的曲線則展示了基于PROTAC的系統的另一個特點，三元復合物平衡呈現鐘形劑量反應曲線。在這個系統中，增加PROTAC的總濃度會導致三元復合物濃度降低（也稱為 "鉤子效應"），大量過剩的PROTAC會使目標蛋白和連接酶各自達到飽和。如果 PROTAC 濃度設置得過高，在某些情況下可能會導致檢測不到這些三元復合物。

預測這種臨界濃度和促進正協同效應以提高三元復合物的穩定性，被認為都是PROTAC誘導的三元復合物形成的有效方案。

與其他方法相比，質量光度法（MP）實驗不需要對蛋白質進行標記或固定，可對溶液中的真實分子行為進行直接可視化和量化，因此可以對三元復合物形成的關鍵環節提供重要數據。

我們這次實驗使用了一個經過充分研究的BRD4（包含兩個溴結構域BD1和BD2）、VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復合物和MZ1（PROTAC）系統。BRD4的失調與多種癌癥的發病有關，基于PROTAC技術的BRD4降解器已成為一種新型療法。

下圖顯示了質量分布隨MZ1濃度增加而變化的情況。BRD4和實驗中使用的 VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復合物的分子量非常相似：VHL為 41.3 kDa，含有BD1和BD2 結構域的BRD4為 47.5 kDa。據報道，MZ1與VHL的親和力為～100 nM，而BD1和BD2的溴化結構域都能與MZ1結合，對結構域的測量結果分別為 380 nM（BD1）和120 nM（BD2）。BRD4的濃度為 50 nM，而VHL/ElonginC/ElonginB連接酶復合物的濃度調整為100 nM。在實驗中，三元復合物（所有BRD分子都參與）的完全形成將導致兩個峰值，一個在50 kDa（剩余的VHL），一個在100 kDa（BRD4-MZ1- VHL復合物），檢測到的事件數量大致相同。MZ1 濃度為1200 nM時，VHL和BRD4達到飽和狀態，三元復合物的濃度驟降。

正如預期的那樣，在沒有PROTAC的情況下，檢測到一個約50 kDa的單峰，表明BRD4和VHL之間沒有蛋白-蛋白相互作用（VHL和BRD4之間的質量差無法分辨）。在 20 nM MZ1 時，就出現了第二個群體，對應于BRD4-MZ1-VHL復合物。50 kDa的峰值對應于游離的VHL 和BRD4，以及與PROTAC分子的復合物，由于質量差異較小，這些復合物無法分辨。將 MZ1 濃度提高到100 nM會進一步增加BRD4-MZ1-VHL三元復合物的比例，并導致 BRD4-MZ1?-VHL?二元復合物的形成。由于VHL的濃度是BRD4的兩倍，因此 50 kDa 處的剩余峰值主要反映了游離連接酶的情況。當 PROTAC 濃度超過 1000 nM 時，觀察到形成的三元復合物數量突然下降，這是二元相互作用取代三元復合物形成的結果。

綜上所述，質量光度法可用于檢測三元復合物的形成，并量化中間物種的相對濃度。重要的是，其結果是在溶液中獲得的，在溶液中所有成分都存在并可自由相互作用，這與其他方法截然不同，后者只能將 "預形成 "的二元復合物與其中一種成分結合，以評估協同效應。此外，由于質量光度實驗不需要標記或固定，并且可以在nM濃度下工作，因此大大節省了時間和材料，從而可以對生理相關蛋白質濃度下的相互作用進行詳細表征。